菌种传代培养

适用于所有检定菌的传代、贮存、接种。

目   的：建立一个检定用菌的传代、贮存、接种操作规程。

范   围：适用于所有检定菌的传代、贮存、接种。

责任人：质量检验部部长  微生物检验员  无菌检验人员  抗生素生物检定检验人员

内   容：

1  检定菌的来源：检定菌种由中国药品生物制品检定所提供的冷冻干燥品（安瓶）。或由药检部门提供已接种好的菌种斜面。

2  检定菌的传代和接种：

2.1  芽胞杆菌3～6个月（其他细菌每个月）用普通琼脂斜面传代1次，将新传代的培养物代替原有的菌种，作为工作用（阳性对照）菌种。传代和接种在菌种接种室内按无菌操作要求进行。

       2.2  准备妥冷冻菌种安瓶或菌种斜面，灭菌的毛细滴管、双碟、镊子、注射器、肉汤培养基、灭菌水及普通琼脂斜面，移入接种室。

       2.3  冷冻菌种安瓶的接种。

2.3.1  用75%酒精棉擦净菌种安瓿的外壁，稍干。

2.3.2  点燃酒精灯，将安瓿的封口，一端在火焰上烧灼红热用毛细管吸取灭菌水少许在灼热处，使其骤冷而炸裂，

2.3.3  在不离开火焰圈内，迅速用注射器取约0.3ml肉汤培养基加入安瓿内，并摇动使冷冻块溶解，摇匀，用注射器吸取安瓿内容物分别接种至1支肉汤培养基、2支普通琼脂斜面培养基。

2.3.4  将接种后肉汤培养基及普通琼脂斜面于37℃恒温培养24小时。

       2.3.5  取出培养物，仔细观察菌落形态，有无杂菌，并转接3支普通琼脂斜面。于37℃恒温培养24h，供菌种保存与传代用，同时作平板分离单个菌落及涂片镜检，应为典型的菌型。

       2.4  检定菌的传代

       2.4.1  将菌种管与接种管均用75%酒精棉擦净外壁，稍干。

2.4.2  先点燃酒精灯，在火焰旁的上部空间操作。烧灼接种环。

2.4.3  再将菌种管与接种管持在左手拇指、食指及中指之间，要注意能清楚地观察到斜面，菌种管在前，接种管在后。应斜持试管呈45°角，使试管内斜面向上，两试管口平齐，注意不要持成水平，以免管底凝集水浸湿培养基表面。

2.4.4  首先，以右手在火焰旁转动两管的棉塞，以便接种时易于拔取。再以右手持接种环的柄端，垂直或稍斜地把接种环在火焰上烧灼。顶端的环必须烧红，以彻底灭菌。环以上凡接种时可进入试管的部分，也应通过火焰烧灼。烧灼时，应把环置于酒精灯的外焰上，因外焰的温度比内焰高，容易烧红。

2.4.5  使用右手的小指和手掌之间以及无名指与小指之间，在火焰旁分别拔出两支试管的棉塞，持住。再将试管口在火焰上通过，以杀灭管口可能沾污的细菌，但勿烧烫。

2.4.6  先将烧灼过的接种环插入菌种管内，先接触无菌苔生长的培养基上，如有熔印则表明接种环未冷却，能烫死细菌。一定待冷后，再从斜面上挑取菌苔少许。取出时接种环不能通过火焰，应在火焰旁迅速插入接种管，在斜面上轻轻划线接种。划线时一般先由下而上划一直线后，再由下而上划曲线。操作过程应迅速，勿使菌苔沾至管壁或管口。

2.4.7  当接种完毕，立即将管口通过火焰灭菌，右手到火焰旁塞上棉塞，不要将管口离开火焰旁去迎接右手的棉塞。最后将接种环烧灼灭菌放置原处，再把可能未塞紧的棉塞塞紧，即可进行培养。

2.4.8  操作过程中，如因不慎使棉塞触及火焰而着火，切勿用口吹，须在刚刚着火时迅速塞入试管，因管内氧气不足会很快熄灭。若棉塞外端着火,可用手捏熄。若棉塞烧坏不宜再用，可另取末接种斜面培养基上的灭菌棉塞，代替塞上。

2.5  传代和接种使用后，应记好记录。

2.6  每只保存菌种需标明菌名、统一编号、接种日期。接种管编号书写规则：由一个中文字和两个阿拉伯数字组成，两个阿拉伯数字之间用“—”号隔开，中文字表示菌种名称，第一个阿拉伯数字表示传代代数，第二个阿拉伯数字表示该代的第几号管，书写格式如“金1-2”，则表示这是金黄色葡萄球菌的第1代的2号管。

3  检定菌种的保存

3.1  将购来的菌种放入冰箱中冷藏保存。

3.2  将菌种斜面培养物置于冰箱保存。保存温度4～6℃。

4  菌悬液的制备

4.1  金黄色葡萄球菌菌液，取金黄色葡萄球菌[CMMC（B）26003]的营养琼脂斜面新鲜培养物1白金耳，接种至营养肉汤培养基内，在30～35℃培养16～18小时后，用0.9%无菌氯化钠溶液稀释至每1ml中含10～100个菌。

4.2  生孢梭菌菌液：取生孢梭力[CMMC（B）6494]的需气菌、厌气菌培养基新鲜培养物1白金耳，再接种至相同培养基内，在30～35℃培养18～24小时后,用0.9%无菌氯化钠溶液稀释至每1ml中含10～100个菌。

4.3  白色念珠菌菌液：取白色念珠菌[CMCC（F）98001]的真菌琼脂培养基斜面新鲜物1白金耳，接种至真菌培养基内，在20～25℃培养24个小时后，用0.9%无菌氯化钠溶液稀释到每1ml中含10～100个菌。

       4.4  大肠杆菌菌液：取大肠杆菌[CMCC（B）44102]的营养琼脂斜面新鲜培养物1白金耳，接种至胆盐乳糖增菌培养基内，在30～35℃培养16～18小时后，用0.9%无菌氯化钠溶液稀释至每1ml中含10～100个菌。

4.5  藤黄微球菌菌液：取藤黄微球菌[CMCC（B）28001]的营养琼脂斜面新鲜培养物1白金耳，接种到需气、厌气培养基内，在30～35℃培养18～24小时后，用0.9%无菌氯化钠溶液稀释至每1ml中含10～100个菌。