菌种传代培养

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  • 所属分类:分析化学类

建立一个检定用菌的传代、贮存、接种操作规程。

实验原理

适用于所有检定菌的传代、贮存、接种。

实验步骤

目   的:建立一个检定用菌的传代、贮存、接种操作规程。

范   围:适用于所有检定菌的传代、贮存、接种。

责任人:质量检验部部长  微生物检验员  无菌检验人员  抗生素生物检定检验人员

内   容:

1  检定菌的来源:检定菌种由中国药品生物制品检定所提供的冷冻干燥品(安瓶)。或由药检部门提供已接种好的菌种斜面。

2  检定菌的传代和接种:

2.1  芽胞杆菌3~6个月(其他细菌每个月)用普通琼脂斜面传代1次,将新传代的培养物代替原有的菌种,作为工作用(阳性对照)菌种。传代和接种在菌种接种室内按无菌操作要求进行。

       2.2  准备妥冷冻菌种安瓶或菌种斜面,灭菌的毛细滴管、双碟、镊子、注射器、肉汤培养基、灭菌水及普通琼脂斜面,移入接种室。

       2.3  冷冻菌种安瓶的接种。

2.3.1  用75%酒精棉擦净菌种安瓿的外壁,稍干。

2.3.2  点燃酒精灯,将安瓿的封口,一端在火焰上烧灼红热用毛细管吸取灭菌水少许在灼热处,使其骤冷而炸裂,

2.3.3  在不离开火焰圈内,迅速用注射器取约0.3ml肉汤培养基加入安瓿内,并摇动使冷冻块溶解,摇匀,用注射器吸取安瓿内容物分别接种至1支肉汤培养基、2支普通琼脂斜面培养基。

2.3.4  将接种后肉汤培养基及普通琼脂斜面于37℃恒温培养24小时。

       2.3.5  取出培养物,仔细观察菌落形态,有无杂菌,并转接3支普通琼脂斜面。于37℃恒温培养24h,供菌种保存与传代用,同时作平板分离单个菌落及涂片镜检,应为典型的菌型。

       2.4  检定菌的传代

       2.4.1  将菌种管与接种管均用75%酒精棉擦净外壁,稍干。

2.4.2  先点燃酒精灯,在火焰旁的上部空间操作。烧灼接种环。

2.4.3  再将菌种管与接种管持在左手拇指、食指及中指之间,要注意能清楚地观察到斜面,菌种管在前,接种管在后。应斜持试管呈45°角,使试管内斜面向上,两试管口平齐,注意不要持成水平,以免管底凝集水浸湿培养基表面。

2.4.4  首先,以右手在火焰旁转动两管的棉塞,以便接种时易于拔取。再以右手持接种环的柄端,垂直或稍斜地把接种环在火焰上烧灼。顶端的环必须烧红,以彻底灭菌。环以上凡接种时可进入试管的部分,也应通过火焰烧灼。烧灼时,应把环置于酒精灯的外焰上,因外焰的温度比内焰高,容易烧红。

2.4.5  使用右手的小指和手掌之间以及无名指与小指之间,在火焰旁分别拔出两支试管的棉塞,持住。再将试管口在火焰上通过,以杀灭管口可能沾污的细菌,但勿烧烫。

2.4.6  先将烧灼过的接种环插入菌种管内,先接触无菌苔生长的培养基上,如有熔印则表明接种环未冷却,能烫死细菌。一定待冷后,再从斜面上挑取菌苔少许。取出时接种环不能通过火焰,应在火焰旁迅速插入接种管,在斜面上轻轻划线接种。划线时一般先由下而上划一直线后,再由下而上划曲线。操作过程应迅速,勿使菌苔沾至管壁或管口。

2.4.7  当接种完毕,立即将管口通过火焰灭菌,右手到火焰旁塞上棉塞,不要将管口离开火焰旁去迎接右手的棉塞。最后将接种环烧灼灭菌放置原处,再把可能未塞紧的棉塞塞紧,即可进行培养。

2.4.8  操作过程中,如因不慎使棉塞触及火焰而着火,切勿用口吹,须在刚刚着火时迅速塞入试管,因管内氧气不足会很快熄灭。若棉塞外端着火,可用手捏熄。若棉塞烧坏不宜再用,可另取末接种斜面培养基上的灭菌棉塞,代替塞上。

2.5  传代和接种使用后,应记好记录。

2.6  每只保存菌种需标明菌名、统一编号、接种日期。接种管编号书写规则:由一个中文字和两个阿拉伯数字组成,两个阿拉伯数字之间用“—”号隔开,中文字表示菌种名称,第一个阿拉伯数字表示传代代数,第二个阿拉伯数字表示该代的第几号管,书写格式如“金1-2”,则表示这是金黄色葡萄球菌的第1代的2号管。

3  检定菌种的保存

3.1  将购来的菌种放入冰箱中冷藏保存。

3.2  将菌种斜面培养物置于冰箱保存。保存温度4~6℃。

4  菌悬液的制备

4.1  金黄色葡萄球菌菌液,取金黄色葡萄球菌[CMMC(B)26003]的营养琼脂斜面新鲜培养物1白金耳,接种至营养肉汤培养基内,在30~35℃培养16~18小时后,用0.9%无菌氯化钠溶液稀释至每1ml中含10~100个菌。

4.2  生孢梭菌菌液:取生孢梭力[CMMC(B)6494]的需气菌、厌气菌培养基新鲜培养物1白金耳,再接种至相同培养基内,在30~35℃培养18~24小时后,用0.9%无菌氯化钠溶液稀释至每1ml中含10~100个菌。

4.3  白色念珠菌菌液:取白色念珠菌[CMCC(F)98001]的真菌琼脂培养基斜面新鲜物1白金耳,接种至真菌培养基内,在20~25℃培养24个小时后,用0.9%无菌氯化钠溶液稀释到每1ml中含10~100个菌。

       4.4  大肠杆菌菌液:取大肠杆菌[CMCC(B)44102]的营养琼脂斜面新鲜培养物1白金耳,接种至胆盐乳糖增菌培养基内,在30~35℃培养16~18小时后,用0.9%无菌氯化钠溶液稀释至每1ml中含10~100个菌。

4.5  藤黄微球菌菌液:取藤黄微球菌[CMCC(B)28001]的营养琼脂斜面新鲜培养物1白金耳,接种到需气、厌气培养基内,在30~35℃培养18~24小时后,用0.9%无菌氯化钠溶液稀释至每1ml中含10~100个菌。

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